Phytochelatin signal tranduction and cadmium chelation in plants

As plantas utilizam diversas estratégias de sinalização para reconhecer e responder aos stresses ambientais. A maioria das vias de transdução de sinais partilham um sinal genérico, normalmente a modulação dos níveis intracelulares de Ca2+. Esta por sua vez pode iniciar uma cascata de fosforilação proteica que finalmente afecta as proteínas directamente envolvidas na protecção celular ou culmina em factores de transcrição que vão determinar a resposta fisiológica ao stresse. A percepção destes sinais e a compreensão de como estes podem activar as respostas adaptativas são factores-chave para a tolerância das plantas a stresses abióticos. Um dos principais stresses abóticos que restrigem o crescimento das plantas é a presença de metais pesados. A produção de fitoquelatinas e a subsequente quelação dos metais é o mecanismo mais conhecido de tolerância ao stresse metálico em plantas. Fitoquelatinas (PCs) são péptidos com grupos tiol que são sintetizados através da transpeptidação da glutationa (GSH), pela acção da enzima fitoquelatina sintase (PCS). No entanto, até ao momento, as vias de sinalização que levam à síntese de fitoquelatinas e à percepção do stresse metálico são pouco compreendidas. Dentro deste contexto, o presente trabalho foi elaborado com o intuito de elucidar a via de sinalização através da qual o cádmio é detectado pelas células vegetais e induz a síntese de PCs. Quase todos, os estudos de stresses abióticos em plantas apontam para o facto de a sua sinalização se basear nos mesmos tipos de sinais moleculares, nomeadamente a sinalização por cálcio, a fosforilação proteica e a indução de espécies reactivas de oxigénio (ROS). Trabalhos recentes sugerem que a sinalização de PCs poderá envolver todos estes parâmetros. Assim, uma primeira abordagem foi efectuada para compreender a síntese de PCs na espécie Arabidopsis thaliana, através da monitorizaçção da actividade de enzimas relacionadas, a γ-EC sintetase, GSH sintetase e a PC sintase (PCS), assim como o tempo necessário para o elongamento das PCs e a sua acumulação. Seguidamente, ao longo deste processo foi analisada a expressão de sinais específicos, associados com sinais de cálcio, fosforilação proteica e sinalização por ROS. A importância destes factores na síntese de PCs foi também avaliada através do uso de moduladores farmacológicos de cálcio e fosfatases proteicas e também pela indução de stresse oxidativo. Os resultados demonstraram novos dados sobre o papel do cálcio e da fosforilação proteica na produção de PCs e na síntese de GSH, revelando que a actvidade da PCS é regulada por fosforilação e que a sinalização de cálcio pode mediar a síntese de GSH. O envolvimento da sinalização de ROS na síntese de GSH, atráves de crosstalk com a sinalização de cálcio também foi proposta. Assim, os resultados aqui apresentados descrevem uma possível via de sinalização de cádmio nas plantas e da indução de fitoquelatinas. Este trabalho poderá ser portanto muito útil na implementação de novas metodologias de agricultura sustentável e práticas de fitorremediação em solos contaminados com metais pesados.

Pancreatic zymogen granules: new proteins in unexpected places

Os mecanismos de biogénese, distribuição apical e secreção regulada de enzimas digestivas dos grânulos de zimogénio são, atualmente, pouco conhecidos. De modo a esclarecer e descrever estes processos de elevada importância biológica e clínica, é necessária uma melhor compreensão dos componentes da membrana granular e as funções e interações destes. Neste trabalho, através de uma abordagem proteómica, foi possível identificar novas proteínas granulares previamente associadas ao transporte vesicular sináptico. Para estudar as funções destas proteínas na génese e secreção de grânulos, foram realizados estudos de sobre-expressão, assim como estudos bioquímicos (1D, 2D, and LC-MS/MS) e morfológicos, utilizando céluas de mamífero. Entre as proteínas descobertas, cinco foram selecionadas e analisadas: RMCP-1, Piccolo, Synaptojanin-1, APP e ZG16p. Destas proteínas, confirmou-se a presença da RMCP-1 e APP nos grânulos de zimogénio. Interessantamente, o lectin ZG16p da secreção pâncreatico, encontra-se expressa no cérebro de rato, estando localizada nos terminais pós-sinápticos e em grânulos de RNA, indicando uma possível função desta proteína na formação das vesículas sinápticas. Finalmente, demonstrei que a formação de grânulos de zimogénio pode ser modulada, no modelo de células pancreáticas AR42J, pelas condições de cultura. Em contraste com as proteínas de carga neuroendocrinas, a sobreexpressão de proteínas de carga ou da membrana dos grânulos de zimogénio não foi suficiente para induzir a formação de grânulos ou de estruturas granulares em células constitutivamente secretoras, indicando diferenças na biogénese de grânulos neuroendócrinos e exócrinos.

Characterization of PPP1 interacting proteins in male reproduction

A fosforilação reversível de proteínas é um importante mecanismo de controlo em eucariotas. A fosfoproteína fosfatase 1 (PPP1) é uma fosfatase de serina/treonina envolvida em vários processos celulares. Existem três isoformas da subunidade catalítica (α/CA, δ/β/CB e γ/CC) com pequenas diferenças nos terminais amino e carboxílico. O gene PPP1CC sofre ainda splicing alternativo para produzir duas isoformas, a PPP1CC1 ubíqua e a PPP1CC2 enriquecida em testículo e específica de esperma. A localização e especificidade de substratos da PPP1 está dependente da formação de complexos oligoméricos com proteínas que interagem com a PPP1 (PIPs). O objetivo principal desta tese foi estudar novas PIPs, específicas de testículo e esperma, a fim de melhor caracterizar o papel desta fosfatase e dos respetivos complexos na reprodução em mamíferos. Com este fim, estudou-se a presença, localização e possíveis funções de uma PIP previamente conhecida, PPP1R2, e de duas novas PIPs, PPP1R2P3 e Tctex1d4. PPP1R2 e PPP1R2P3 estão presentes em esperma humano colocalizando com a PPP1CC2, na cabeça e na cauda. A hipótese é que as holoenzimas localizadas na cabeça terão um papel na reação acrossómica, enquanto que as holoenzimas presentes no axonema são relevantes para o controlo da motilidade flagelar. De seguida foram estudados os pseudogenes da PPP1R2, em termos de história evolutiva e de possíveis funções. Na espécie humana, a PPP1R2 tem 10 pseudogenes, 7 deles específicos de primatas. Estudos de bioinformática e dados de expressão mostram que os PPP1R2P1/P3/P9 são os pseudogenes com maior probabilidade de serem transcritos e traduzidos. Também identificámos o PPP1R2P9 em esperma humano e mostrámos que alguns pseudogenes poderão estar associados a estados fisiopatológicos. Isto indica que o processo de evolução poderá estar ligado á formação de novos genes ou ao controlo do mRNA da PPP1R2. A sobre-expressão da PPP1R2 ou PPP1R2P3 em testículo de ratinho também foi realizada, para caracterizar os mecanismos envolvidas na função dos complexos PPP1R2/PPP1R2P3-PPP1CC2 na espermatogénese e fisiologia dos espermatozoides. A dineína de cadeia leve, Tctex1d4, foi encontrada como interagindo com a PPP1C e como estando presente em testículo de ratinho e em esperma humano. Demonstrámos que a Tctex1d4 e a PPP1 colocalizam no centro organizador de microtúbulos e nos microtúbulos e que o motivo de ligação à PPP1 presente na Tctex1d4 parece ser importante para manter a PPP1 no centro organizador de microtúbulos e/ou para disromper ou atrasar o seu movimento ao longo dos microtúbulos emergentes. Estes resultados abrem novos caminhos para os possíveis papéis do complexo Tctex1d4-PPP1 na dinâmica dos microtúbulos, motilidade do esperma, reação acrossómica e na regulação da barreira hemato-testicular, provavelmente, através da via de sinalização do TGFß. A análise do motivo de ligação à PPP1 mostra que este é altamente conservado entre os mamíferos, com exceção das Pikas, sugerindo que esta perda aconteceu antes da radiação das Pikas, há 6-20 milhões de anos atrás. Através de um rastreio por mutações demonstrámos que a capacidade da Tctex1d4 se ligar à PPP1 é mantida nas Pikas, embora o motivo de ligação à PPP1 esteja disrompido. Este estudo abre portas para novas descobertas na área da reprodução mostrando o papel da PPP1CC2 na espermatogénese e fisiologia do esperma.